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q 【Trans 實驗常見問題和解答】細胞培養 -- 冷凍管應如何解凍?

a 取出冷凍管後,須立即放入37℃水槽中快速解凍,輕搖冷凍管使其在1分鍾內全部融化,並注意水麵不可超過冷凍管蓋沿,否則易發生汙染情形。另冷凍管由液氮桶中取出解凍時,必須注意安全,預防冷凍管之爆裂。

q 【Trans 實驗常見問題和解答】Western Blot -- 什麽都曝不出來

a 看膜上有無預染條帶,有的話證明轉膜沒問題;
檢查一抗、二抗、發光液是否好用,顯影液定影液配製時間不能太長,重新 進行實驗;

q 【Trans 實驗常見問題和解答】Western Blot -- estern marker曝光太亮

a 縮短曝光時間,用咱們的發光液十幾秒即可;
較少marker上樣量,但同時預染條帶也會較弱;

q 【Trans 實驗常見問題和解答】Western Blot -- Western blot 結果中信號弱或無信號

a 可能的原因:
蛋白未轉到膜上
對策:
轉膜結束後,用總蛋白染色劑染膠來確定轉膜效率。(注:總蛋白染色劑 可能檢測不到低量的抗原。)
確保轉膜過程中膠與膜完全接觸。
確保轉印夾層排布正確
確保按照膜的製造商的使用說明潤濕膜
確保轉印部件在電印跡過程中未過熱
使用正對照和/或分子量Marker
優化轉印時間和電流
確保樣品製備條件優於蛋白印跡,為破壞樣品的抗原性。(注意:許多蛋 白不能在還原狀態下進行)
可能的原因:
蛋白未完全結合到膜上
對策:
在轉膜緩衝液中加入20%的甲醇促進結合。低分子量的抗原可能會穿過轉印膜,需使用小孔徑的膜進行。
可能的原因:
抗體不足
對策:
增加抗體濃度。抗體與目標蛋白的親和力可能很小
抗體可能失活,可用斑點印跡檢測其活性。
可能的原因:
抗體濃度太高
對策:
使用太多一抗或二抗可能導致信號迅速消失,呈現出很弱的信號。
可能的原因:
抗原不足
對策:
加入更多的蛋白進行跑膠
抗原被封閉液掩蔽
試用不同的封閉液
優化封閉液中蛋白濃度
可能的原因:
緩衝液中含有疊氮鈉
對策:
疊氮鈉是一種HRP的抑製劑,緩衝液不能使用疊氮鈉作為防腐劑
可能的原因:
曝光時間太短
對策:
延長膠片的曝光時間(注意:超感應化學發光底物會持續發光至少6個小時
可能的原因:
底物孵育時間太短
對策:
使用超感應底物時需規定時間的底物孵育

q 【Trans 實驗常見問題和解答】Western Blot -- Western blot 結果中背景高且不均勻

a 可能的原因:
抗體濃度太高
對策:
一抗或二抗濃度太高會導致高背景,降低抗體濃度
可能的原因:
使用的封閉液不兼容
對策:
對比不同的封閉緩衝液
可能的原因:
非特異性位點封閉不足
對策:
優化封閉緩衝液,最好的封閉緩衝液具有係統依賴性
提高封閉液中蛋白的濃度
優化封閉時間和/或溫度。室溫封閉至少1 h或者4℃封閉過夜
在封閉液中加入Tween-20,Tween-20的終濃度為0.05%
可能的原因:
封閉液中與其它蛋白發生抗體的交叉反應
對策:
換一種不同的封閉液
不要用含抗生素蛋白的牛奶封閉,牛奶含生物素
交叉反應的檢測。封閉一張幹淨的膜,與抗體一起孵育,然後用超感應化學發光底物檢測
可能的原因:
洗滌不充分,增加洗滌次數和使用緩衝液的體積
對策:
降低HRP結合物的濃度
如果洗滌液中無Tween-20,添加Tween-20使其終濃度為0.05%
可能的原因:
膜的曝光時間過久
對策:
縮短印跡膜曝光到膠片的時間
按照說明書的指示,保證膜始終是濕潤的
用一張新膜
保證膜完全被液體覆蓋,避免其幹燥
在孵育過程中始終進行震蕩
小心夾膜——損壞膜可能導致非特異性結合
不能空手持膜,始終帶幹淨手套或用鑷子
可能的原因:
緩衝液汙染或結塊沉澱
對策:
製備新的緩衝液
可能的原因:
抗體濃度太高
對策:
若一抗和/或二抗濃度過高會產生高背景,降低抗體濃度
可能的原因:
緩衝液中有汙染
對策:
使用新的緩衝液
緩衝液使用前過濾
可能的原因:
操作設備被汙染
對策:
保證電泳儀器、印跡儀器和孵育用容器清潔,無外緣汙染物
保證在轉膜後沒有凝膠留在膜上,蛋白可能黏在膠上導致背景