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q 【Trans 實驗常見問題和解答】細胞水平檢測 -- 細胞增殖活性檢測注意事項

a 1) 選擇適當的細胞接種濃度。一般情況下,96孔培養板的一內貼壁細胞長滿時約有10^5個細胞。但由於不同細胞貼壁後麵積差異很大,因此,在進行MTT試驗前,要進行預實驗檢測其貼壁率、倍增時間以及不同接種細胞數條件下的生長曲線,確定試驗中每孔的接種細胞數和培養時間,以保證培養終止致細胞過滿。這樣, 才能保證MTT結晶形成酌量與細胞數呈的線性關係。否則細胞數太多敏感性降低,太少觀察不到差異。
2) 藥物濃度的設定。一定要多看文獻,參考別人的結果再定個比較大的範圍先初篩。根據自己初篩的結果縮小濃度和時間範圍再細篩。切記!否則,可能你用的時間和濃度根本不是藥物的有效濃度和時間。
3) 時間點的設定。在不同時間點的測定OD值,輸入excel表,最後得到不同時間點的抑製率變化情況,畫出變化的曲線,曲線什麽時候變得平坦了(到了平台期)那個時間點應該就是最好的時間點(因為這個時候的細胞增殖抑製表現的最明顯)。
4) 培養時間。200ul的培養液對於10的4~5次方的增殖期細胞來說,很難維持68h,如果營養不夠的話,細胞會由增殖期漸漸趨向G0期而趨於靜止,影響結果,我們是在48h換液的。
5) MTT法隻能測定細胞相對數和相對活力,不能測定細胞絕對數。做MTT時,盡量無菌操作,因為細菌也可以導致MTT比色OD值的升高。
6) 理論未必都是對的。要根據自己的實際情況調整。
7)實驗時應設置調零孔,對照孔,加藥孔。調零孔加培養基、MTT、二甲基亞碸。對照孔和加藥孔都要加細胞、培養液、MTT、二甲基亞碸,不同的是對照孔加溶解藥物的介質,而加藥組加入不同濃度的藥物。
8)避免血清幹擾。用含15%胎牛血清培養液培養細胞時,高的血清物質會影響試驗孔的光吸收值。由於試驗本底增加,會試驗敏感性。因此,一般選小於10%胎牛血清的培養液進行。在呈色後,盡量吸淨培養孔內殘餘培養液。

q 【Trans 實驗常見問題和解答】細胞水平檢測 -- 雙熒光素酶報告基因檢測結果

a 檢測前應檢測孔板或空管的發光值,作為儀器發光背景值,Modulus多功能檢測儀的儀器背景值應小於100;
樣品檢測發光值應該遠大於儀器背景值,例如10000。如果樣品發光值過於接近儀器背景值,說明樣品中熒光素酶過少,需要考慮轉染量、轉染效率、裂解效率等因素。

q 【Trans 實驗常見問題和解答】細胞水平檢測 -- 雙熒光素酶報告基因最適反應溫度

a 室溫(20-22℃)。各個組分(細胞裂解產物,底物工作液等)都需要調整到室溫。

q 【Trans 實驗常見問題和解答】細胞水平檢測 -- 雙熒光素酶報告基因的載體比例

a 根據實驗具體情況調整。建議作一個預實驗來調整(螢火蟲載體與海腎載體比例分別用1:10、1:20、1:50、1:100),螢火蟲熒光素酶檢測發光值大於海腎熒光素酶發光值的比例較好。

q 【Trans 實驗常見問題和解答】細胞水平檢測 -- 報告基因檢測注意事項

a 1) 報告基因檢測受多種因素影響(載體狀態、細胞狀態、轉染量、轉染效率、裂解效率、加樣精度、檢測過程等),因此同批次樣品檢測值也可能出現浮動。所以實驗一般需要做3個或3個以上複孔,並且引入另一個報告基因作為內參。
2)細胞培養時間不宜過長,12-36h內最好;長時間培養後,細胞難裂解。
3)雙熒光素酶報告基因的載體選擇:
a)螢火蟲熒光素酶建議選取pGL-3或pGL-4的載體或自己構建相應的載體;
b)海腎熒光素酶建議選取phRL-TK或pGL-4代載體或自己構建相應的載體。建議海腎載體不使用強啟動子(如SV40、CMV),而選用中等強度的啟動子(如TK)。